DESPRE PROTEINE

Despre proteine

Proteinele sunt substanţe organice macromoleculare formate din lanţuri simple sau complexe de aminoacizi; ele sunt prezente în celulele tuturor organismelor vii în proporţie de peste 50% din greutatea uscată. Toate proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, în care secvenţa acestora este codificată de către o genă. Fiecare proteină are secvenţa ei unică de aminoacizi, determinată de secvenţa nucleotidică a genei.

1. Etimologie

Prima menţionare a cuvântului proteină este făcută de către descoperitorul acesteia Jöns Jakob Berzelius, în scrisoarea sa către Gerhardus Johannes Mulder din 10 iulie 1838, scrisoare în care menţionează:

"The name protein that I propose for the organic oxide of fibrin and albumin, I wanted to derive from [the Greek word] πρωτειος, because it appears to be the primitive or principal substance of animal nutrition".

(Numele de proteină îl propun pentru denumirea compusului organic rezultat prin oxidarea fibrinei sau albuminei, el derivă din grecescul πρωτειος, deoarece se pare că apare ca fiind principala substanţă din nutriţia animalelor).

2. Sinteza proteinelor

Biosinteza

 

La nivelul ribozomilor se realizează translaţia informaţiei genetice de la ARNm în lanţul polipeptidic.În nucleu ARN m copiază informaţia genetică de la ADN nuclear iar apoi migrează în citoplasmă.Fiecare moleculă de ARNt posedă la mijlocul lanţului său un anticodon a căror 3 baze consecutive se pot asocia prin legături de hidrogen cu 3 baze complementare de un codon ARNm.Pe baza acestui anticodon aminoacizii vor fi poziţionaţi conform mesajului genetic din ARNm. Această poziţionare a aminoacil-ARNt se realizează la suprafaţa ribozomului la nivelul a 2 locusuri stereospecifice:locul"P"(peptidil) şi locul "A" (aminoacil), situate la suprafaţa subunităţilor.

Biosinteza proteinelor este un proces prin care fiecare celulă îşi sintetizează proteinele proprii, prin intermediul unui proces care include multe etape, sinteza începînd cu procesul de transcripţie şi terminînd cu procesul de translaţie.Procesul deşi similar, este diferit în funcţie de de celulă: eucariotă sau procariotă.

Transcripţia

Procesul de transcripţie necesită prezenţa unei singure molecule de ADN dublucatenar, numit ADN „şablon”, moleculă care intră în procesul de „iniţiere”.Aici acţionează enzima ARNpolimeraza, enzimă care se leagă de o anumită regiune din molecula de ADN , regiune (denumită promoter) din care va începe transcripţia.Pe măsură ce ARN polimeraza se leagă de promoter, lanţurile de ADN vor începe sa se desfacă.Următorul proces în care intră ADN este procesul de elongaţie (alungire a catenei).Pe măsură ce ARN polimeraza se mişcă de-a lungul catenei de ADN, are loc sinteza ribonucleotidelor complementare (ARNm ARN mesager).Acest ARN după cum îi arată şi numele se poate deplasa şi în alte părţi ale celulei cum ar fi reticulul endoplasmatic sau citoplasma.

Gruparea 5' se găseşte în capătul 5'final al moleculei de ARNm, şi este format din guanosină grefată printr-o legătură de tip 5'- 5' de molecula de ARN prin intermediul unei legături trifosfat.

.Are loc adiţia unei grupări 5', grupare dinucleotidică care are rolul de a asigura stabilitatea ARN şi de a-l transforma în ARN matur.O secvenţă de aminoacizi este grefată în poziţia 3' terminală pentru protecţie dar şi pentru a sluji drept şablon pentru procesele următoare.Mai departe are loc formarea ARN, care este apoi utilizat in ribozomi pentru sinteza proteinelor.La procariote legarea ARN de ribosomi are loc după ce acesta este îndepărtat de nucleoid; în contrast la procariote acest proces are loc chiar în membrana nucleară şi apoi translocat în citoplasmă.Rata sintezei proteică poate ajunge la circa 20 aminoacizi la procariote, mult mai puţin la eucariote.

Translaţia

În timpul translaţiei ARNm transcris din ADN este decodat de ribozomi pentru sinteza proteinelor.Acest proces este divizat în 3 etape:

• Iniţierea
• Elongarea
• Faza terminală.

Ribozomul are situsu-ri de legare care permit altei molecule de ARNt (ARN de transfer), să se lege de o moleculă de ARn m, proces însoţit de prezenţa unui anticodon.Pe măsură ce ribozomul migrează de-a lungul moleculei de ARNm (un codon o dată) o altă moleculă de ARNt este ataşată ARNm.Are loc eliberarea ARNt primar, iar aminoacidul care este ataşat de acesta este legat de ARNt secundar, care îl leagă de o altă moleculă de aminoacid.Translaţia continuă pe măsură ce lanţul de aminoacid este format.La un moment dat apare un codon de stop, o secvenţă formată din 3 nucleotide (UAG, UAA), care semnalează sfîrşitul lanţului proteic.Chiar după termminarea translaţiei lanţurile proteice pot suferi modificări post-translaţionale şi plierea lanţului proteic, responsabilă de structura secundară şi cea terţiară.Modificările post-translaţionale se referă la posibilitatea formării de legături disulfidice, sau de ataşarea la scheletul proteic a diferite grupări ca rol biochimic: acetat, fosfat etc.

Sinteza chimică

Procesul de sinteză chimică poate avea loc în laborator , dar pentru lanţuri mici de proteine.O serie de reacţii chimice cunoscute sub denumirea de sinteza peptidelor,permit producerea de cantităţi mari de proteine.Prin sinteza chimică se permite introducerea în lanţul proteic a aminoacizilor ne-naturali, ataşarea de exemplu a unor grupări fluorescente.Metodele sunt utilizate în biochimie şi in biologia celulei .Sinteza are la bază cuplarea grupării carboxil -COOH (carbon terminus) cu gruparea -amino -NH₂ (segmentul N terminus). Se cunosc 2 metode de sinteză pe cale chimică_

• Sinteza în fază lichidă metoda clasică care a fost înlocuită cu sinteza în fază solidă.
• Sinteza în fază solidă (Solid-phase peptide synthesis SPPS), a cărei bază a fost pusă de Robert Bruce Merrifield.Prin aceată metodă , se pot sintetiza proteine D , cu aminoacizi D.În prima fază Merrifield a folosit metoda tBoc (terţ-butil-oxi-carbonil).Pentru înlăturarea acestuia din lanţul peptidic se foloseşte acidul fluorhidric (HF) , care este foarte nociv, periculos, iar din acest motiv , metoda nu se mai utilizează.Atunci cînd este vorba de sinteza analogilor peptidici non-naturali de tip bază (depsi-peptidele) este necesară.

O altă metodă este cea introdusă de R.C. Sheppard în anul 1971, şi are la bază folosirea Fmoc (fluorenil metoxi carbonil), iar pentru înepărtarea acesteia se foloseşte de obicei mediu bazic asigurat de o soluţie 20% piperidină/DMF (dimetil formamidă).Îndepărtarea grupării din lanţul proteic se face prin incubare în acid trifluoracetic (TFA).

Această grupă de protejare cu simetrie ortogonală se foloseşte în multe sinteze chimice.

Protejarea grupării prin intermediul Fmoc este de obicei lentă, deoarece anionul nitro produs la sfîrşitul reacţiei nu este un produs favorabil desfăşurării reacţiei.

Rol

Datorită compoziţiei, fiind formate exclusiv din aminoacizi se întîlnesc alături de alţi compuşi importanţi de tipul polizaharidelor, lipidelor şi acizilor nucleici începînd cu structura virusurilor, a organismelor procariote, eucariote şi terminînd cu omul.Practic nu se concepe viaţă fără proteine.Proteinele pot fi enzime care catalizează diferite reacţii biochimice în organism, altele pot juca un rol important în menţinerea integrităţii celulare (proteinele din peretele celular), în răspunsul imun şi autoimun al organismului.

Nutriţia

Majoritatea microorganismelor şi plantelor pot sintetiza toţi cei 20 aminoacizi standard, în timp ce organismele animale obţin anumiţi aminoacizi din dietă (aminoacizii esenţiali).Enzime cheie cum ar fi de exemplu aspartatkinaza , enzimă care catalizează prima etapă în sinteza aminoacizilor lisină, metionină şi treonină din acidul aspartic, nu sunt prezente în organismele de tip animal.La aceste organisme aminoacizii se obţin prin consumul hranei conţinînd proteine.Proteinele ingerate sunt supuse acţiunii acidului clorhidric din stomac şi acţiunii enzimelor numite proteaze, proces în urma căruia lanţurile proteice sunt scindate (denaturate).Ingestia aminoacizilor esenţiali este foarte importantă pentru sănătatea organismului, deoarece fără aceşti aminoacizi nu se poate desfăşura sinteza proteinelor necesare organismului.De asemenea aminoacizii sunt o sursă importantă de azot;unii aminoacizi nu sunt utilizaţi direct în sinteza proteică, ci sunt introduşi în procesul de gluconeogeneză, proces prin care organismul asigură necesarul de glucoză în perioadele de înfometare (mai ales proteienele aflate în muşchi).

Tipuri de proteine

În funcţie de compoziţia lor chimică ele pot fi clasificate în:

• Holoproteine cu următoarele clase de proteine
• Proteine globulare (sferoproteine) sunt de regulă substanţe solubile în apă sau în soluţii saline:protaminele, histonele, prolaminele, glutelinele, globulinele, albuminele.
• Proteinele fibrilare (scleroproteinele) caracteristice regnului animal, cu rol de susţinere, protecţie şi rezistenţă mecanică:colagenul, cheratina şi elastina.
• Heteroproteinele sunt proteine complexe care sunt constituite din o parte proteică şi o parte prostetică; în funcţie de această grupare se pot clasifica astfel:
• Glicoproteine
• Lipoproteine
• Nucleoproteine

3. Proprietăţi fizico-chimice

Masă moleculară

Datorită formării aproape în exclusivitate din aminoacizi, putem considera proteinele ca fiind de fapt nişte polipeptide, cu masă moleculară foarte mare intre 10.000 şi 6.000.0000.Masa moleculară se determină prin diferite metode, mai ales în cazul proteinelor cu masa moleculară foarte mare ca de exemplu proteina C reactivă. Masa moleculară a diferitelor proteine

 

 

Denumirea proteinei	Sursa proteinei/Izolată din	Masa moleculară
Lactalbumină	lapte	17000
Gliadina	grîu	27.500
Insulina	pancreas	12,000
Hordeina	orz	27.500
Hemoglobina	globule roşii	68.000
Hemocianina	moluşte(sînge) , artropode(sînge)	2.800.00
Miozina	muşchi	850.000
Pepsină	stomac	36.000
Peroxidaza	rinichi	44.000
Virusul mozaicului tutunului (capsida)	tutun	17.000.000

Deoarece la multe proteine masa moleculară apare ca un multiplu de 17,500, multă vreme s-a mers pe ipoteza că particulele proteice sunt formate prin unirea mai multor molecule de bază ce au masa moleculară în jurul valorii de 17,500. Aceste molecule de bază s-ar putea uni între ele prin aşa numitele valenţe reziduale, ducînd la formarea de agregate moleculare.Atunci cînd are loc ruperea acestor valenţe reziduale ar avea loc doar modificarea proprietţilor fizice ale proteinelor, în timp ce dacă are loc ruperea legăturilor principale (legăturile peptidice), proteina îşi modifică proprietăţile fizico-chimice.

Solubilitatea proteinelor

Proteinele sunt substanţe solide, macromoleculare, solubile în general în apă şi insolubile în solvenţi organici nepolari.Unele proteine sunt solubile în apă dar insolubile în alcool, altele sunt solubile în soluţii apoase de electroliţi, acizi organici. Datorită gradului diferit de solubilitate în diferiţi solvenţi, proteinele se pot izola, identifica şi separa. Solubilitatea lor depinde foarte mult de legăturile care se stabilesc între grupările libere de la suprafaţa macromoleculelor şi moleculele solventului.La suprafaţa macromoleculelor proteice se găsesc grupări libere de tip polar,-COOH, -NH₂, -OH, -SH, -NH, grupări cu caracter hidrofil care favorizează dizolvarea proteinelor în apă.De asemenea există grupări de tip apolar, hidrofobe, de regulă radicali de hidrocarburi -CH₃, -C₆H₅, -C₂H₅, care favorizează dizolvarea proteinelor în alcool. Însă în martea lor majoritate predomină grupările polare,determinante pentru caracterul hidrofil. În contact cu apa proteinele greu solubile manifestă fenomenul de gonflare, datorită tendinţei de hidratare datorată grupărilor polare. Gelatina de exemplu se îmbibă foarte puternic cu apa dînd naştere prin răcire la geluri. La dizolvarea proteinelor în apă, are loc fenomenul de formare a coloizilor hidrofili. S-a constatat că în soluţii diluate se găsesc macromolecule proteice izolate, iar în cazul soluţiilor concentrate se formează agregate de macromolecule proteice. Soluţiile coloidale ale proteinelor, coagulează prin încălzire, prezintă efectul Tyndall(dispersia fasciculului de lumină).

Punctul izoelectric şi caracterul amfoter

Caracter amfoter

Proteinele la fel ca şi aminoacizii sunt substnţe amfotere şi formează în soluţii apoase amfioni: , în prezenţa H₂O

În mediu acid proteinele se comportă ca baze slabe ele primind protoni şi fomînd cationi proteici: , cation al proteinei. reacţia stă la baza electroforezei proteinelor,datorită incărcării pozitive cationii migrează spre catod, fenomen numit cataforeză, proteina fiind în acest caz electropozitivă.

În mediu bazic proteinele se comportă ca acizii slabi ele cedînd protoni, se formează astfel anioni proteici, care migrează spre anod fenomenul fiind denumit anaforeză, proteina avînd încărcare electronegativă. , anion al proteinei. datorită caracterului amfoter proteinele pot neutraliza cantităţi mici9 de substanţă acidă sau bazică, avind în acest fel rol de soluţie tampon, prin acest lucru contribuind la menţinerea echilibrului acido-bazic al organismului. În general caracterul amfoter este imprimat de cele grupările -NH₂ şi -COOH libere care nu sunt implicate în legaăturile peptidice.Dacă în molecula proteinei există mai mulţi aminoacizi dicarboxilici atunci molecula se va comporta ca un acid slab, iar în cele în care predomină aminoacizii diaminaţi se comportă ca baze slabe. Chiar dacă într-o moleculă există un număr egal de grupări amino si carboxil,deci teoretic molecula ar trebui sa fie neutră, în realitate datorită gradului de ionizare mult mai mare a grupării carboxil faţă de gruparea amino, molecula proteinei va avea un caracter slab acid, în soluţia ei întîlnindu-se amfiioni proteici, anioni proteici şi protoni (H⁺ )

Punct izoelectric

Prin acidulare echilibrul reacţiei se deplasează spre formarea de cationi proteici.La o anumită concentraţie a H⁺, proteina devine neutră deoarece gruparea aminică şi cea carboxilică sunt la fel de disociate şi deci molecula este neutră din punct de vedere electric. În acel moment se vor găsi în soluţie amfiioni, H⁺, ioni hidroxil -HO; pH-ul la care soluţia unei proteine conţine anioni şi cationi în proporţie egală poarta denumirea de punct izoelectric , se notează cu pHi, fiind o constantă foarte importantă a proteinelor şi nu numai.Fiecare proteină la punctul, izoelectric are un comportament specific, avînd o solubilitate si reactivitate chimică minimă; de asemenea hidratarea particulelor coloidale , vîscozitatea şi presiunea osmotică sunt de asemenea minime. Precipitarea proteinei în schimb la punctul izoelectric este în schimb maximă, dar nu se deplasează sub influenţa curentului electric.De obicei valorile punctului izoelectric variază între 2,9 şi 12,5 şi se determină prin diferite metode:potenţiometrice, electroforetice.

Precipitarea proteinelor

Sub acţiunea diferiţilor factori fizici (ultrasunete, radiaţii cu diferite lungimi de undă, căldură), factori chimici (acizi, baze, diferiţi solvenţi organici), sau mecanici (agitare), are loc fenomenul de precipitare a proteinelor, precipitarea care poate fi reversibilă sau ireversibilă.

Precipitare reversibilă

Precipitarea reversibilă se poate produce sub acţiunea soluţiilor concentrateale sărurilor alcaline dar şi în prezenţa unor dizoilvanţi organici miscibili cu apa în orice proporţie, cum sunt de exemplu acetona şi alcoolul.În cadrul acestei preciptări molecula proteinei suferă unele modificări fizico-chimice, dar nu are loc afectarea structurii moleculare. Puterea de precipitare a proteinelor de către diferiţi ioni este data de seria liofilă a lui Hofmeister. Dacă anionul rămîne acelaşi, puterea de precipitare a cationilor scade în următoarea ordine: Li⁺>Na⁺>NH₄⁺> cănd cationul ramîne acelaşi anionii se comportă astfel: SO₄²->PO₄³->CH₃COO->Citrat->tartrat->Cl^->NO₃^->ClO₃^->Br^->I^->SCN^-. Solvenţii de tipul alcoolului sau acetonei în funcţie de concentraţia lor pot forma fie precipitate reversibile sau ireversibile. Sărurile alcaline au un comportamnt diferit faţă de proteine, în soluţii diluate mărind solubilitatea proteinelor, iar în soluţii concentrate determinînd precipitarea lor reversibilă. De altfel soluţiile sărurilor alcaline de diferite concentraţii se folosesc pentru precipitarea fracţionată a proteinelor din amestecuri.

Precipitare ireversibilă

În cursul acestei precipitări molecula proteinei suferă modificări fizico-chimice ireversibile avînd loc şi modoficarea structurii moleculare. De regulă se produce la adăugarea de soluţii ale metalelor grele (Cu,Pb, Hg, Fe, a acizilor minerali tari (HNO3, H2SO4) acidul tricloracetic, a soluţiilor concentrate de alcool sau acetonă, sau in cazul anumitor proteine în prezenţa căldurii. Prin precipitare ireversibilă, după cum arată şi numele proteinele îşi pierd activitatea lor biologică (enzimatică, hormonală, etc.), are loc o descreştere a solubilităţii, modificarea activităţii optice, de asemenea sunt mai uşor de degradat sub acţiunea unor enzime proteolitice. Prin îndepărtarea factorilor care au dus la precipitare, proetienele nu revin la forma lor iniţială şi nu işi pot reface structura moleculară. Proteinele precipitate îşi pierd din proprietăţile hidrofile "obţînînd" proprietăţi hidrofobe.

4. Proprietăţi chimice

Aminoacizi standard

Din punct de vedere chimic, proteinele sunt heteropolimeri constituiţi din 20 de L-α aminoacizi (aşa numiţii aminoacizi standard vezi tabelul), în care grupările carboxil se pot combina cu grupările amino formînd legături peptidice, formînd lanţurile peptidice. Aminoacizii standard au proprietăţi variate, proprietăţi care sunt direct responsabile de structura tridimensională a proteinei, dar şi de proprietăţile acesteia.

Denumirea  (Residue)	cod 3-litere	cod 1 literă code	Abundenţă />(%) E.C.
Alanină	ALA	A	13.0
Arginină	ARG	R	5.3
Asparagină	ASN	N	9.9
Aspartat	ASP	D	9.9
Cisteină	CYS	C	1.8
Acid glutamic	GLU	E	10.8
Glutamină	GLN	Q	10.8
Glicină	GLY	G	7.8
Histidină	HIS	H	0.7
Isoleucină	ILE	I	4.4
Leucină	LEU	L	7.8
Lizină	LYS	K	7.0
Metionină	MET	M	3.8
Fenilalanină	PHE	F	3.3
Prolină	PRO	P	4.6
Serină	SER	S	6.0
Treonină	THR	T	4.6
Triptofan	TRP	W	1.0
Tirosină	TYR	Y	2.2
Valină	VAL	V	6.0

(4) În lanţul polipeptidic aminoacizii formează legăturile peptidice prin cuplarea grupei carboxil cu o grupă amino;odată legat în lanţul proteic aminoacidul se "transformă" în aminoacid "rezidual" iat atomii d ecarbon , azot, hidrogen şi oxigen implicaţi în legături formează "scheletul" proteinei.Atunci cînd lanţul proteic se tremină cvu o grupă carboxil poartă denumirea de carboxi terminus sau( C -terminus), în timp ce, dacă se termină cu gruparea amino, devine amino-terminus (N-terminus).

Responsabile de proprietăţile chimice sunt aceleaşi grupări carboxil şi amino libere, neimplicate în formarea legăturilor peptidice, însă mai intervin şi diferiţii radicali grefaţi pe scheletul proteinei.

• Datorită grupărilor carboxil şi amino libere ele dau aceleaşi reacţi ca şi la aminoacizi.
• Caracterul amfoter este responsabil de formarea de săruri atîz cu bazele cît şi cu acizii
• Legătura peptidică este respoinsabilă de formarea de cobinaţii complexe denumie chelaţi.
• Prezenţa diferiţilor radicali alchilici, sau arilici determină formarea unor derivaţi ai substanţelor proteice (derivaţii halogenaţi şi nitrici sunt cei mai importanţi)

Reacţii de culoare

Datorită existenţei anumitor aminoacizi în molecula proteinelor, alegăturilor peptidice formate în molecula proteinei dar şi grupările funcţionale libere sunt responsabile de reacţiile de culoare.

Denumirea reacţiei	Reactivul folosit	Culoarea rezultată	Tipul de aminoacid identificat
Xantoproteică	acid azotic,hidroxid de amoniu	portocalie	aminoacizii aromatici (formează nitroderivaţi)
Millon	azotat de mercur în acid azotic/azotit	precipitat roşu cărămiziu sau coloraţie roşie	aminoacizi ciclici cu grupare hidroxil (tirosina)
Sulfurii de plumb	Acetat sau azotat de plumb în mediu alcalin	precipitat negru de sulfură de plumb	aminoacizi cu sulf în moleculă : cisteină, metionină cistină
Sakaguchi	α naftol şi hipoclorit de sodiu în mediu bazic	roşie carmin	arginină cu grupare guanidinică
Adamkiewicz-Hopkins	acid acetic glacial/acid glioxilic/acid sulfuric fumans	violetă	aminoacid cu nucleu indolic (triptofan)
Pauly	carbonat de sodiu şi acid diazobenzen sulfonic	roşie vişinie	histidină şi tirosină
Ninhidrinei	ninhidrină	albastră	caracteristică atît pentru aminoacizi cît şi pentru proteine
Biuretului	soluţie diluată de sulfat de cupru în mediu bazic	albastră violetă	legatura peptidică şi se datorează formării de combinaţii complexe
Biuretului	nichel în mediu bazic	portocalie	legătura peptidică
Nitroprusiatului de sodiu	nitroprusiat de sodiu în soluţie amoniacală	roşie	aminoacizi cu grupăre tiol (-SH) liberă

 

 

Structura tridimensională

5. Structura proteinelor

După cum s-a văzut mai sus lanţurile peptidice sunt formate de grupările carboxil şi aminice a aminoacizilor; există de fapt 2 forme pentru fiecare proteină, numite forme de rezonanţă:

• una datorată dublei legături care asigură rigiditatea şi nu permite rotaţia în jurul axei sale;
• a doua formă de rezonanţă este dată de unghiul diedru φ(planul atomilor C'-N-C^α-C'), ψ (planul atomilor N-C^α-C'-N), ω (planul atomilor C^α-C'-N-C^α), unghiurile φ şi ψ pot avea diferite valori fiind responsabile de gradul de libertate a proteinelor, controlînd structura tridimensională a lanţului proteic.

Structura substanţelor proteice este încă insuficient cunoscută datorită dinamicităţii structurii proteinelor, deoarece ele sunt în permanenţă supuse unor procese de sinteză şi de degradare.Pentru evidenţierea succesiunii aminoacizilor în structura proteinelor se folosesc 2 metode:

• Degradarea Edman

Prin degradarea Edman se poate identifica o secvenţă de pînă la 30 aminoacizi, cu o eficienţă de 98%/aminoacid.Un alt avantaj ar fi cantitatea de numai 10-100 picomoli de peptidă necesari pentru determinare.

 

Degradarea Edman foloseşte ca reactiv izotiocianatul de fenil care evidenţiază selectiv aminoacidul.Grupa amino terminală se adiţionează la izotiocianat trecînd printr-un derivat de tiouree.După ce se tratează cu un acid slab, aminoacidul marcat sub formă de feniltiohidantoină se detaşează de restul polipeptidei.Aceasta cu noul său aminoacid terminal poate fi supusă la lat ciclu de tratări pentri identificarea următoarei grupe amino.

• Degradarea Sanger are la bază tratarea polipetidei cu fluoro-2,4-dinitrobenzen, avind loc atacul reactivului asupra grupării amino a aminoacidului N-terminal.Metoda Sanger are dezavantajul degradării complete a polipeptidei.

Unghiul legăturii între C₁ şi N este aproape de 180⁰, similar cu unghiul valenţei din molecula apei

S-a ajuns la concluzia că există 4 niveluri (structuri) , care alcătuiesc edificiul proteic.

Structura primară

Structura primară este dată de aminoacizii care intră în lantul proteic prin formarea legăturilor pepetidice.

 

În structura primară se observă lanţul de aminoacizi

În proteinele naturale legătura peptidică se stabileşte între gruparea carboxilică de la C1 şi gruparea aminică de la C2, încît lanţul peptidic va fi format dintr-o succesiune de unităţi CO-NH-CH ,legate cap-cap.

La unul din capetele lanţului peptidic se găseşte o grupare -NH₂ liberă,iar la celălat capăt seaflă o grupare -COOH liberă

Legătura peptidică -CO-NH- se găseşte în acelaşi plan, iar carbonul -CH- se poate roti, putînd să apară în planuri diferite. Datorită lungimii relativ mici a catenelor laterale, ele se pot aranja de o parte şi de alta a lanţului proteic, astfel că lanţul proteic nu este ramificat.

Datorită deplasării altrenative a unui electron de la gruparea -NH la C=O se produce oscilarea dublei legături de la atomul de carbon şi oxigen la atomul de azot, fomrîndu-se astfel cele 2 forme mezomere.

Datorită numărului relativ mic de aminoacizi care intră în structura proteinelor, teoretic ar trebui să se formeze proteine cu masa moleculară în jur de 4200. Însă în realitate masele moleculare ale proteinelor au valori de peste 10,000 ceea ce a dus la concluzia că cel puţin o parte de aminoacizi se repetă de mai multe ori în cadrul unei molecule. Ipoteza că proteinele sunt foirmte din lanţuir lineare de aminoacizi afost fomulată pentru prima dată înn anul 1902 la a 74-a reuniune a Societăţii Oamenilor de Stiinţă din Germania, ţinută în oraşul Karlsbad, de către Franz Hofmeister (ţinînd cont de reacţia biuretului) şi Emil Fischer (care aduce clarificări asupra scheletului proteic). Ipoteza că în molecula proteinelor există legături amidice fusese elaborată de chimistul francez E Grimaux încă din anul 1882. În ciuda evidenţelor care demonstrau faptul că proteinele supuse acţiunii proteolitice se scindează în oligopeptide, ideea că lanţul proteic este liniar, au fost idei greu de "digerat ". În perioada respectivă, numeroşi savanţi (William Astbury, Hermann Staudinger), punînd la îndoială acest lucru, prin argumentarea că legăturile amidice nu sunt îndeajuns de puternice pentru a susţine o moleculă proteică lungă.

Cu timpul au apărut diverse ipoteze:

• Ipoteza coloidală care susţinea ca proteinele sunt ansambluri moleculare coloidal formate din molecule mai mici-ipoteză contrazisă de măsurarea ultracentrifugării de către Svedberg care arată faptul că proteinele sunt molecule bine definite, au greutate moleculară, iar prin electroforeză Arne Tiselius demonstrează că proteinele sunt molecule unice.
• Ipoteza a 2-a ^[, numită ipoteza ciclol, avansată de Dorothy Wrinch, are la bază 3 elemente:
• Ciclol reaction în care gruparea carbonil şi gruparea amino a 2 peptide se incrucişează C=O + HN → C(OH)-N.(aşa numita legătură în cruce);aceste legături sunt de tip covalent, similare cu legăturile covalente de hidrogen propuse de William Astbury, pentru a explica stabilitatea structurii proteice.
• Lanţurile beta vecine au la bază o serie de reacţii de tip ciclol
• Structura proteinelor mici corespund aşa numitelor "solid de tip Platon, fără ca să existe colţuri libere.

Alte ipoteze au fost lansate de către Emil Abderhalden (modelul dicetopiperazinic),sau Troesengaard în anul 1942 (modelul pirol/piperidină). Toate aceste modele au fost infirmate de Frederick Sanger care reuşeşte să identifice secvenţa aminoacizilor din insulină, dar şi de determinările cristalografice efectuate de Max Perutz şi John Kendrew asupra mioglobinei şi hemoglobinei.

Structura secundară

Imaginea alfa helixurilor mioglobinei, a cărei structură a fost determinată de către Max Perutz şi Sir John Cowdery Kendrew în 1958 folosind cristalografia cu raze X

Structura secundară se referă la forma şi la lungimea lanţurilor polipeptidice, proprietăţi induse de legăturile de hidrogen. Cele mai întîlnite tipuri de structura secundară sunt alpha helixul şi lanţurile beta.

 

Elicea alpha se formează prin rotaţia unui lanţ polipeptidic în jurul propriei axe

Alte helix-uri cum ar fi helixul 310 şi helixul π sunt din punct de vedere energetic favorabile formării legăturilor de hidrogen, dar sunt rareori observat în proteinele naturale exceptînd părţile terminale ale helixului α în timpul formării scheletului proteic (de obicei centrul helixului). Aminoacizii au un comportament diferit vis-a-vis de posibilitatea formării structurii secundare. Prolina şi glicina sunt cunoscuţi ca aşa numiţii " helix breakers"(spărgători de helix), deoarece afectează configuraţia scheletului proteic; ambii aminoacizi au abilităţi conformaţionale neobişnuite şi de regulă se găsesc în colţurile scheletului proteic.Aminoacizii care preferă să adopte conformaţia helixului proteic fac parte din aşa numita serie MALEK ( codurile formate din 1 literă a aminoacizilor: metionină, alanină, leucină, acid glutamic şi lizina); prin contrast aminoacizii aromatici (triptofanul, tirosina şi fenilalanina, dar şi aminoacizii cu legare prin carbonul beta (izoleucina, valina şi treonina, adoptă configuraţia β.

Structura secundară cunoaşte cîteva ipoteze privind formarea ei:

• Teoria polipeptidică formulată de către E. Hoffmeister în 1902 şi dezvoltată ulterioe de către E.Fischer, are la bază conceptul conform căruia moleculele proteice sunt formate din lanţuri polipeptidice foarte lungi. Teoria are cîteva dezavantaje:
• nu explica diferenţierea biologică a anumitopr proteine
• unele proteine sunt rezistente la acţiunea enzimelor proteolitice (deşi datorită lunfimii lanţului nu ar trebui)
• Teoria plierii şi răsucirii lanţului polipeptidice a fost elaborată de către Corey şi Pauling în 1943 şi a fost confirmată prin spectrele de difracţie cu raze X, microscopului electronic , prin măsurarea unghiurilor de valenţă, a distanţelor interatomice, au confirmat faptul că lanţul polipeptidic se găseşte sub formă pliată.
• Structura în foaie pliantă. Plierea catenei are loc prin formarea legăturilor de hidrogen între gruparea carboxilică a unui aminoacid şi gruparea aminică a aminoacidului vecin.Lanţul polipetidic pliat se prezintză ca o panglică îndoită alternativ la dreapta şi la stînga, plierea avînd loc în dreptul carbonilor metinici. Mai multe lanţuri pliate polipeptidice pliate dau naştere unei reţele, între aceste lanţuri pliate putîndu-se de asemenea forma legături de hidrogen, acestea fiind în număr mai mare cînd grupările terminale a 2 lanţuri sunt aranjate diferit (-NH₂ şi COOH, sau HOOC-şi -NH₂). Catenele polipeptidice pliate predomină în proteinele fibrilare şi mai puţin în cele globulare. După valoarea perioadei de identitate se cunosc mai multe tipuri de proteine cu structură pliată. Prin perioada de identitate se înţelege distanţa cea mai mică la care se repetă aminoacizii identici din moleculă
• (6)Structura α elicoidală, ipoteză lansată de Corey şi Pauling, ipoteză conform căreia lanţul polipeptidic se poate prezenta şi înfăşurat sub formă de spirală. În acest model, fiecare spiră cpnţine de obicei 27 aminoacizi, iar distanţa între spire este de 5,44 A⁰. Fiecare aminoacid măreşte spira cu 1,47 A⁰. În faţa fiecărei grupări -CO- va apare la o distanţă de 2,8A⁰. o grupare NH de la al treilea aminoacid. Între aceste grupări se stabilesc punţile de hidrogen care asigură stabilitatea α helix-ului. În acest model lanţul polipeptidic se prezintă sub forma unui surub cu pasul fie spre dreapta, fie spre stînga. În cazul proteinelor naturale, acestea datorită conţinutului în L-aminoacizi,pasul helixului va fi spre dreapta, catenele laterale ies în afara corpului propriu-zis putînd reacţiona fie cu moleculele solventului fie cu alte catene polipeptidice. Canalul format în interiorul helixului este foarte îngust, în el nu poate pătrunde molecula solventului. Legăturile peptidice sunt plane, iar 2 planuri consecutive -CO-NH- formează un unghi de 180⁰, rotirea lanţului se face la carbonul α(metinic).

 

Structura terţiară

Prin intzermediul cristalografiei cu raze X s-a dovedit faptul că macromoleculele proteice au o conformaţie tridrimensională , realizată de obicei prin intermediul cuplării mai multor lanţuri polipeptidice scurte între ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice;legăturile intercatenare pot fi principale sau secundare:

• Legături de hidrogen , sunt legături coordinativ heteropolare care se stabilesc cu uşurinţă între gruparea carbonil C=O (electronegativă) şi gruparea NH- (electropozitivă), din 2 lanţuri polipeptidice alăturate, sau în cazul formelor lactam-lactimă între gruparea -OH şi azotul iminic =NH

 

 

Legăturile de hidrogen au lungimea cuprinsă între 2,7-3,1A şi energia de 3-7Kcal/mol la peptide, iar la apă 2-3Kcal/mol

.Legăturile de hidrogen se pot stabili şi între catenele lateralecare au grupări carboxil, hidroxil, amino sau tiolice. Din punct de vedere energetic ^[17]legătura de hidrogen nu este puternică dar datorită răspîndirii relativ uniforme de-a lungul scheletului proteic oferă proteinei stabilitatea necesară.

• Legături disulfidice

Legătura disulfidică este foarte puternică ,50-100kcal/mol şi are un rol foarte importantîn stabilizarea arhitecturii spaţiale a moleculei proteice

.legătura este rezistentă la hidroliză, însă se poate desface iar prin reducere formează tioli(SH), iar prin oxidare formează acizi.În general legătura sulfidică se întîlneşte la proteinele transformate, care au o rezistenţă mecanică mare.

În afară de aceste legaături se mai pot stabili alte tipuri de legături: legături ionice (stabilite de obicei între grupările aminice şi cele carboxilice ionizate), legături de tip van der Waals (legături electrostatice slabe care se stabilesc între radicalii hidrofobi), legături fosfodiesterice (între 2 resturi de serină şi acid fosforic)legături eterice (stabilite la nivelul aminoacizilor cu grupări hidroxilice.

 

 

Structura cuaternară

structura cuaternară se referă la modul cum se unesc subunităţile proteice.Enzimele care catalizează asamblarea acestor subunităţi poartă denumirea de holoenzime, în care o parte poartă denumirea de subunităţi reglatoare şi subunităţi catalitice.

Vedere 3 D a hemoglobinei cele 4 subunităţi roşu şi galben, iar unitatea hemică verde.numele de hemoglobină vine este formată din hem şi globină , denumire ce denotă faptul că emoglobina are la bază proteine globulare cuplate cu o grupare hem.

         Proteine care au structura cuaternară :hemoglobina, ADN polimeraza şi canalele ionice, dar şi nucleozomi şi nanotubuli, care sunt complexe multiproteice.Fragmentele proteice pot suferi transformări în structura cuaternară, transformări care se reflectă fie în structurile individuale fie în reorientările fiecărei subunităţi proteice.Numărulsubunităţilor din oligomerice sunt denumite prin adăugarea sufix-ului -mer (grecescul pentru subunitate), precedat de numele subunităţii.

 

1 = monomer 2 = dimer 3 = trimer 4 = tetramer 5 = pentamer 6 = hexamer

7 = heptamer 8 = octamer 9 = nonamer 10 = decamer 11 = undecamer 12 = dodecamer

13 = tridecamer 14 = tetradecamer 15 = pentadecamer* 16 = hexadecamer 17 = heptadecamer* 18 = octadecamer

19 = nonadecamer 20 = eicosamer 21-mer 22-mer 23-mer etc.